A⁺B^- 细胞：

makerA 介导 Cre 酶表达，Cre 酶会切除两个 loxP 位点之间的序列（第一个 stop 序列被切除）。该系统按照启动子的方向，表达绿色荧光 ZsGreen。

A⁺B⁺ 细胞：

makerB 介导 Dre 酶表达，Dre 酶会切除两个 Rox 位点之间的序列（绿色荧光 ZsGreen、一对 Loxp 位点与全部的 stop 序列被切除），之后，该系统按照启动子的方向，表达红色荧光 tdTomato。

A^-B⁺ 细胞：

makerB 介导 Dre 酶表达，Dre 酶会切除两个 Rox 位点之间的序列（绿色荧光 ZsGreen、一对 Loxp 位点与全部的 stop 序列被切除），之后，该系统按照启动子的方向，表达红色荧光 tdTomato。

Sox9+ 胆道上皮细胞是否在肝脏再生过程中形成肝细胞仍然存在争议。一些谱系追踪研究报告说，Sox9-CreER 标记的胆道上皮细胞（BEC）可能有助于体内平衡和损伤后的肝细胞；其他研究报告说，新产生的肝细胞来源于损伤后预先存在的肝细胞。值得注意的是，Sox9 在 BEC 和一些门脉周围肝细胞中表达，这导致使用传统的 Sox9-CreER 标记不够准确，新的肝细胞可能来自Sox9-CreER 标记的预先存在的肝细胞。

图. 使用传统的方法标记 Sox9⁺ 细胞无法准确标记 BECs^[2]

因此利用肝细胞特异性标记白蛋白 Alb-DreER与嵌套报告基因系统可区分Sox9+ BEC和Sox9+ 肝细胞。Sox9+ BEC被标记为绿色，Sox9+ Alb+肝细胞被标记为红色，Alb+肝细胞也被标记为红色。至此，精确标记的ZsGreen+ BEC和tdTomato+ 肝细胞可用于重新评估 Sox9+ BEC 在肝脏修复过程中对肝细胞的贡献。针对肝损伤后的小鼠进行荧光检测分析表明，BEC 不会再生新的肝细胞，而只是在CCl₄ 诱导的肝损伤后增殖以补充 BEC。

图. 嵌套报告基因系统准确标记 BECs^[1]

• 嵌套报告基因系统的结构是 Rosa26-CAG-site2-site1-Stop-site1-reporter A-site2-reporter B。

• 嵌套报告系统可用于破解一些定义具有已知阳性和阴性marker的干细胞的细胞命运。

• Dre-rox 和 Cre-loxP 的重组顺序不会影响最终结果

• 更适合使用双诱导型重组系统

• 独家报告基因系统的结构是 Rosa26-CAG-site1-site2-Stop-site1-reporter A-Stop-site2-reporter B。

• 独家报告系统可用于破解一些定义具有已知阳性和阴性marker的干细胞的细胞命运。

• 这种标记存在先后顺序，相反的先后顺序会极大的影响后续的标记结果。

• 建议两个重组酶中一种采用可诱导类型的重组酶，从而合理控制重组发生的先后顺序。

选择哪种双报告系统取决是否需要控制A&B的表达重组酶的时间，以及重组酶的类型选择。

在这种情况下，由于AB表达位置存在发育期表达的干扰，因而需控制A、B蛋白的表达时间，此时存在两种情况：

a. 仅需控制单个marker的表达时间：

以marker A 需控制表达为例，由于marker A需调控表达时间，因而需使用A介导的可诱导的重组酶。此时，B介导的重组酶可以选择可诱导的或者是组成型的（无需诱导）。如果选择组成型的话，请确保A和B发生的重组顺序正确，即可选择独家报告系统；如果选择可诱导的，这时我们需选择嵌套报告系统。

b. 需控制双个marker的表达时间：

这种情况下，A与B都需要选择可诱导的重组酶，这时我们需选择嵌套报告系统。

在这种情况下，无需调控A&B的表达时间，选择哪种双报告系统就取决于重组工具的类型，如果B介导的重组工具是组成型的，而A介导的重组工具是诱导型的，即可选择独家报告系统；如果A和B介导的重组都是可诱导的，即可选择嵌套报告系统。