一文搞懂基因编辑小鼠全流程分子实验，从此鉴定不踩坑

一、基础入门：基因型鉴定核心实验

不同类型的小鼠，鉴定方案各有侧重：

• 阳性鼠鉴定：在敲除片段的两端设计引物。如果敲除成功，PCR产物的条带会比野生型小（大小 = 野生型片段 - 敲除片段）。

• 纯合/杂合子鉴定：阳性鼠（杂合子）自交后会产生野生型、杂合子和纯合子三种后代。若敲除片段不大，上述一对引物即可区分（图1）。若敲除片段过大导致野生型片段无法扩增，则需要在敲除片段内部再设计一条引物，通过两对引物PCR来区分（图2）。PCR后对目标编辑区域进行Sanger测序能精准确认碱基序列的变化，判断编辑是否完全符合预期。
  

这类模型（如flox小鼠）的鉴定更为复杂，需要验证同源臂和loxP位点是否正确插入。

• F0代验证：通常需要多对引物分别验证5'同源臂、3'同源臂和两端的loxP位点。

• F1代验证：PCR阳性结果后，通常还需Southern Blot进一步确认。

• F2代纯杂合鉴定：F1代自交后，只需用一对位于loxP位点附近的引物进行PCR，根据条带大小即可区分野生型、杂合子和纯合子（图3）。
  

点突变由于只是单碱基或少数碱基的增加、缺失或替换，无法通过电泳条带大小进行区分。

• 酶切法：若突变引入或破坏了某个限制性内切酶的识别位点，可通过PCR后对产物进行酶切来鉴定。

• 测序法：最可靠的方法是将PCR产物直接测序，通过分析峰图确认点突变（图4）。

对于随机插入的转基因小鼠，必须确认外源基因的整合情况才能保证后续实验的稳定性。再确认插入位置前只能通过阳性和阴性作为区分，并且阳性鼠繁育只能和WT进行繁育。插入位置可通过染色体荧光原位杂交实验在显微镜下直接观察外源基因在染色体上的定位，或全基因组测序确定它整合到了哪一条染色体的具体位置；而定量斑点杂交、数字PCR实验，则能精准统计外源基因在基因组中的整合拷贝数，避免因为多拷贝随机插入导致后续传代表型分离。

• DNA模板：高质量DNA是成功的关键。常用鼠尾或脚趾、耳朵组织，通过碱裂解法或酶消化法（如蛋白酶K）提取DNA，OD值260/280在2.0左右，PCR上样DNA量控制在50-100ng。

• 对照设置：实验必须包含野生型对照、空白对照（无DNA模板）和内部阳性对照。

• 引物与程序：引物设计要特异，GC含量在40%-60%。对于复杂模板，可尝试梯度降落PCR（Touch down PCR）减少非特异性扩增。

二、表达层面验证：功能确认核心实验

从目标组织中提取总RNA，逆转录合成cDNA后进行扩增，既能定性检测目的基因的mRNA是否存在，也能通过荧光定量的方式精准统计基因的表达水平。特别适合检测基因全身性敲除小鼠的目标基因是否完全敲除，条件性敲除目的基因敲除效率或者过表达小鼠的外源基因是否在特定组织中成功转录。

如果目标基因和内源同源基因序列相似度很高，选择高特异性的引物，就能有效避免非特异性扩增带来的结果误差。

这是RNA水平检测的经典方法，将提取的总RNA电泳转膜后，用特异性探针杂交，直接显示目标mRNA的大小和表达量。它能直观验证转录本的完整性，判断是否出现异常剪接的转录产物，在转基因和内源基因序列差异较大的场景中应用非常广泛。

直接从组织中提取总蛋白，通过电泳、转膜后用特异性抗体检测目标蛋白的表达情况，确认基因编辑是否成功实现了蛋白层面的功能改变。比如构建全身性敲除小鼠，就需要通过Western Blot验证在目标组织中，目的蛋白是否完全不表达，或条件性基因敲除小鼠后验证除目标组织外其他非靶向组织中蛋白表达不受影响等。

除了验证蛋白是否表达，还能直观看到蛋白在组织中的定位和表达分布。比如构建的荧光报告基因小鼠，通过免疫荧光染色就能直接在显微镜下观察到荧光蛋白在不同组织、不同细胞类型中的表达情况，验证报告系统的工作效率。

三、高阶应用：功能研究拓展实验

• 单细胞测序实验：能从单个细胞层面解析基因编辑后不同细胞类群的转录组变化。

• 组织学染色：通过HE染色观察组织病理变化或用油红O染色观察脂质积聚等。

• 生理生化指标检测：检测血液中的血脂、血糖等生理生化指标。

• 免疫学：ELISA, ELISPOT, 胞内流式, 增殖/杀伤实验，肿瘤药效等。

• 行为学：旷场实验、明暗场实验 、高架十字实验、Y迷宫、水迷宫等。