STTT | IF=52.7！TRIDENT方案“策反”中性粒细胞，强势突破晚期肺癌生存期记录

5月7日，四川大学华西医院薛建新研究员、卢铀教授和罗忍团队在Signal Transduction and Targeted Therapy发表论文，题为“Low-dose radiotherapy synergizes with PD-1 blockade to achieve durable survival in advanced NSCLC through antitumor neutrophil programming”，该项研究开发了TRIDENT（Triple Radio-Immunotherapy-Driven ENhanced Therapy）三联疗法，阐明了放疗与免疫治疗的优化联合策略，在晚期非小细胞肺癌患者中取得了显著的生存获益。

在该研究的前瞻性I期临床试验（NCT03812549）中，初治、PD-L1阳性的晚期NSCLC患者接受了TRIDENT方案治疗，该方案整合了对大病灶的LDRT、对小病灶的局灶HDRT以及联合全身性PD-1阻断剂信迪利单抗，不联合化疗。共入组29例NSCLC患者（图1a，b）。截至2025年4月1日，中位随访时间为62.5个月（范围：54.6-70.3），中位OS为51.3个月（95%置信区间[CI]，20.7-未达到）（图1c），数值上超过了帕博利珠单抗单药（14.8个月）或联合化疗（22.5个月）的历史结果。客观缓解率（ORR）为60.7%，中位PFS为8.6个月（95% CI，3.7-16.5）。作为一个示例病例，一名71岁男性诊断为IV期（cT4N3M1）低分化肺腺癌，伴有肺、纵隔、腋窝和颅内受累（PD-L1 26-49%）。他接受了TRIDENT治疗：对左下叶病灶行HDRT 30 Gy/3次，对bulky左肺门肿瘤行LDRT 4 Gy/2次，联合全身性αPD-1（信迪利单抗）。两个周期后，患者达到部分缓解（PR），并持续了62个月。HDRT后观察到无症状的放射性肺炎（图1d），这些结果尽管存在跨试验比较的固有限制，但仍是有意义的临床信号。

图1 TRIDENT疗法在初治晚期NSCLC中延长生存期

TRIDENT在晚期NSCLC中显示出临床活性，能诱导持久获益，其免疫机制值得探索。为确定最优LDRT方案，研究者重新分析了小鼠单侧CT26肿瘤接受不同分割照射的转录组数据，发现单次2 Gy诱导的免疫应答最强，CD4⁺/CD8⁺T细胞、B细胞和树突状细胞浸润增加，免疫多样性指数（Shannon熵）显著升高（图2a，b）。这些发现为选择2 Gy×1作为后续双肿瘤实验中评估TRIDENT疗效的LDRT方案提供了机制依据。采用双侧小鼠肿瘤模型以模拟转移性疾病的多个病灶设置，并评估TRINDENT诱导的系统性抗肿瘤免疫。研究者在双侧LLC或CT26模型中实施TRIDENT：原发灶(T1)接受HDRT(8 Gy×3)，第二灶(T2)接受LDRT(2 Gy×1)，联合全身PD-1阻断（图2c）。包含HDRT的方案几乎根除了原发肿瘤（图2d，g）。但双组分方案（如HDRT+αPD-1等）均未显著抑制二次肿瘤生长，无法引发系统性抗肿瘤应答（图2e，h）；只有TRIDENT显著抑制了双瘤生长并延长生存（图2e，i）。为探究机制，对LLC模型二次肿瘤进行单细胞测序，发现TRIDENT组中性粒细胞浸润显著增加（图2j-l），流式证实（图2m，n）。清除中性粒细胞仅轻度削弱原发灶控制，但导致二次肿瘤控制丧失和生存期缩短（图2o-q）。这些数据表明，TRIDENT在双侧小鼠模型中引发了强大的、依赖中性粒细胞的全身性肿瘤控制，尤其有效地抑制了远处（二次）肿瘤。

图2 TRIDENT在小鼠中驱动中性粒细胞依赖性的系统性抗肿瘤免疫

对所有组别中肿瘤浸润中性粒细胞的单细胞分析，通过UMAP可视化鉴定了四个不同的亚群（图3a, b）。其中N1群与ICI应答特征一致（图3c），在TRIDENT处理小鼠的二次肿瘤中频率上升（图3d）。N1群高表达Tnf和Cd14（图3b），具有T细胞刺激特征，故命名为TNF-α⁺中性粒细胞。流式证实TRIDENT后二次肿瘤中TNF-α⁺和TNF-α⁺CD14⁺中性粒细胞显著扩增（图3e，f），同时CD14⁺CD101⁻和CD14⁺CD62L⁺成熟活化亚群也增加（图3g，h）。TRIDENT还增加了两个肿瘤模型中CD8⁺T细胞浸润（图3i，j）。对T/NK细胞聚类发现六个亚群（图3k），其中CD8_Effector T亚群在TRIDENT组富集，细胞毒性评分最高（图3l，m），并表现出增强的IFN应答、细胞毒性和效应功能（图3n）。流式证实TRIDENT后CD8⁺T细胞中穿孔素、IFN-γ、TNF-α和颗粒酶B表达增加（图3o-r）。清除CD8⁺T细胞仅轻度影响原发灶控制，但导致二次肿瘤控制丧失和生存期缩短（图3s-u）。提示TRIDENT诱导TNF-α⁺中性粒细胞和细胞毒性CD8⁺T细胞，协同介导系统性抗肿瘤免疫。

图3 TRIDENT在二次肿瘤中扩增TNF-α⁺中性粒细胞和效应CD8⁺T细胞

研究者发现二次肿瘤中TNF-α⁺中性粒细胞与CD8⁺T细胞丰度强正相关（图4a），提示二者存在功能互作。通路富集显示TRIDENT组中IFN-γ应答及抗原加工呈递上调（图4b）。为了研究中性粒细胞如何在功能上支持二次肿瘤中的CD8⁺T细胞应答，研究者对单细胞转录组进行了受体-配体相互作用分析，结果表明，N1_TNF-α⁺中性粒细胞通过MHC分子与CD8⁺T细胞上的CD8受体结合（图4c）。流式证实TRIDENT后MHC-I⁺、MHC-II⁺、CD86⁺、CCR7⁺及4-1BBL⁺中性粒细胞增加（图4d-h），CD8⁺T细胞也上调4-1BB（图4i）。GM-CSF/IFN-γ刺激的中性粒细胞上调抗原呈递相关分子，并增强OVA交叉呈递（图4j）。与CD8⁺T细胞共培养时，N1_TNF-α⁺中性粒细胞促进T细胞活化和增殖，PD-1阻断进一步增强（图4k-o）；在三细胞共培养中增加肿瘤细胞凋亡（图4p）。过继转移N1_TNF-α⁺中性粒细胞联合αPD-1可延缓肿瘤生长并延长生存（图4q-s）。这表明，TRIDENT诱导的N1_TNF-α⁺中性粒细胞具有抗肿瘤特性，可能在体外通过抗原呈递和共刺激激活CD8⁺T细胞，并在过继转移到荷瘤小鼠体内后发挥抗肿瘤效应。

图4 TNF-α⁺中性粒细胞表现出抗肿瘤特性并激活CD8⁺T细胞

鉴于有效的中性粒细胞-T细胞结合可能依赖于黏附介导的免疫突触形成，研究者接下来分析了TRIDENT中这种相互作用的分子基础。为了探究N1_TNF-α⁺中性粒细胞与CD8⁺T细胞之间的配体-受体相互作用，研究者收集了二次肿瘤的单细胞转录组信息，分析显示，TRIDENT特异性富集了N1_TNF-α⁺中性粒细胞与CD8⁺T细胞之间的Icam1-Itgal相互作用（图5a,b）。ICAM-1与LFA-1的互作对免疫突触形成至关重要。流式证实TRIDENT后中性粒细胞ICAM-1和CD8⁺T细胞LFA-1α上调（图5d，e），免疫荧光也显示LFA-1α增加（图5c）。N1_TNF-α⁺中性粒细胞高表达ICAM-1（图5f，g）。基于CD8⁺T细胞与抗肿瘤中性粒细胞之间可能形成免疫突触的假设，研究者将这些细胞共培养，然后使用成像流式细胞术进行分析。对CD8和Ly-6G双阳性细胞群体的分析发现了两类双联体亚群。与对照组相比，N1_TNF-α⁺中性粒细胞显示出显著更高比例的低偏心率。这表示，N1_TNF-α⁺中性粒细胞可能与CD8⁺T细胞形成更多免疫突触样相互作用（图5h）。LFA-1α阻断抑制了T细胞增殖和活化（图5i-m），体内阻断也削弱了二次肿瘤控制和生存期（图5n-p）。些数据证实，ICAM-1-LFA-1是一个关键的分子桥梁，在TRIDENT中介导中性粒细胞与T细胞之间的相互通讯，并支持与免疫突触样形成相一致的粘附依赖性相互作用，尤其是在接受低剂量放疗（LDRT）处理的二次肿瘤中。

图5 ICAM-1-LFA-1相互作用驱动TRIDENT诱导应答中的中性粒细胞的T细胞结合及其细胞毒性

为了研究TRIDENT如何促进抗肿瘤中性粒细胞的积累，研究者检测了它们在TME中的募集（趋化）和表型编程（极化）机制。在无治疗、LDRT或HDRT后收集肿瘤，体外培养以产生条件培养基（图6a）。Transwell迁移实验显示，来自LDRT处理肿瘤的条件培养基相较于来自未处理或HDRT处理肿瘤的培养基，显著增强了中性粒细胞迁移（图6b）。体内验证也证实LDRT肿瘤募集更多CD45.1⁺中性粒细胞（图6c，d）。单细胞转录组和流式表明，TRIDENT组中性粒细胞中Cxcr2上调，CXCR2⁺频率增加（图6e，f）。LDRT诱导Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3表达（图6g），体内阻断CXCR2显著削弱TRIDENT的远隔疗效（图6h-j），确立CXCL-CXCR2为关键趋化轴。极化方面，LDRT后Csf2（GM-CSF）和Ifng（IFN-γ）上调（图6k，l）。LDRT条件培养基诱导体外幼稚中性粒细胞高表达CD14、ICAM-1、MHC-I、CD86（图6m-p）。体内中和GM-CSF或IFN-γ也削弱二次肿瘤控制和生存期（图6q-s）。这些发现表明，TRIDENT通过CXCL-CXCR2轴招募中性粒细胞，并通过GM-CSF和IFN-γ将其编程为抗肿瘤表型，从而促进其在肿瘤内的积累并增强T细胞介导的抗肿瘤免疫。

图6 TRIDENT诱导趋化和极化信号，招募中性粒细胞并将其编程为抗肿瘤表型

为了在NSCLC中验证TRIDENT治疗的原位机制，研究者使用Visium HD空间转录组学技术，分析了3例接受TRIDENT治疗的NSCLC患者的配对基线和治疗后肿瘤组织的FFPE切片（图7a）。RCTD（Robust Cell Type Decomposition）显示，治疗后免疫浸润和活化增加（图7b），抗原加工呈递通路上调（图7c）。通过CellCharter鉴定出11个生态位（Niche）（图7d，e）。生态位9位于肿瘤核心区域，富含上皮细胞和N1_TNF-α⁺中性粒细胞，TRIDENT治疗后抗原加工通路增强（图7h）。生态位8位于肿瘤边缘，以N1_TNF-α⁺中性粒细胞为主，趋化因子和抗原呈递信号升高（图7i）。生态位5由N1_TNF-α⁺中性粒细胞、CD8⁺效应T细胞等共享，呈现中性粒细胞趋化、IFN-γ活化和T细胞效应程序，是关键的免疫枢纽（图7g，j）。多重免疫组化证实MPO⁺TNF-α⁺CD14⁺ICAM-1⁺中性粒细胞与CD8⁺T细胞空间共定位（图7k）。综上，这些发现为TRIDENT通过N1_TNF-α⁺中性粒细胞相关级联反应重塑TME的工作模型提供了探索性转化支持：N1_TNF-α⁺中性粒细胞浸润肿瘤巢以采样正在死亡/已死亡的肿瘤细胞并加工抗原，在肿瘤边缘形成趋化前沿引导CD8⁺T细胞，随后与炎症枢纽中的效应群体汇聚，协调局部免疫活化和细胞毒性应答，驱动肿瘤消退（图7l）。

图7 高分辨率空间图谱证实N1_TNF-α⁺介导的免疫激活

研究者接下来检测了中性粒细胞活化与多个患者队列中治疗结局之间的关联。首先，研究者在接受TRIDENT为基础治疗的NSCLC患者回顾性队列中探索了外周血中性粒细胞的预后意义。根据治疗前后绝对中性粒细胞计数的变化对患者进行分层。跨队列分析显示，较高的瘤内N1_TNF-α⁺中性粒细胞相关基因特征评分始终与更长的PFS相关，强调了中性粒细胞活化的临床相关性（图8a-d）。最后，研究者在12例接受放射免疫治疗的晚期肺癌患者观察性队列中评估了N1_TNF-α⁺中性粒细胞与临床结局之间的关联（图8e）。应答者（8例部分缓解患者）在治疗后显示出TNF-α⁺、CD14⁺、TNF-α⁺CD14⁺和TNF-α⁺ICAM-1⁺中性粒细胞的显著增加，而在无应答者（4例疾病稳定或进展患者）中未观察到此类增加（图8f-i）。这些发现表明，较高水平的N1_TNF-α⁺中性粒细胞与临床应答改善相关。总之，治疗相关的中性粒细胞增加，特别是N1_TNF-α⁺亚群，在各队列中均与改善的临床结局相关。这种临床关联与本研究确定的N1_TNF-α⁺中性粒细胞在抗肿瘤免疫中的机制作用一致，并突显了其作为治疗应答生物标志物的潜力。

图8 TNF-α⁺中性粒细胞活化与临床效果相关

关于我们